乳糖不耐的成因是乳糖酶缺乏。乳糖是一种双糖，广泛存在于乳汁和乳制品中。乳糖在消化系统内，需要在乳糖酶的催化下分解为葡萄糖和半乳糖后，才能被吸收。婴儿通常可以正常合成乳糖酶，从而消化母乳中的乳糖。断奶后，乳糖酶的合成会逐渐减少。如果由于种种原因导致小肠内乳糖酶不足，那么未经消化的乳糖会从小肠进入大肠。大肠内的微生物利用乳糖发酵，产生大量气体（氢气、二氧化碳、甲烷的混合物），引起腹胀、放屁等症状。同时，未消化的糖分和发酵产物会使大肠内的渗透压升高，导致流入肠道内的水量增加，从而引起腹泻。这就是乳糖不耐。
乳糖酶缺乏主要由遗传因素导致。大多数哺乳动物的幼体在断乳后，开始逐渐的减少乳糖酶的合成。人类第2号染色体上的LCT 基因负责乳糖酶的合成，成年后，该基因的活动减弱，造成乳糖不耐。人类的幼儿在4岁的时候通常会失去90%的乳糖消化能力，但各人、各族群之间的差异很大。几千甚至上万年前，一些人类族群出现基因突变，使得LCT 基因在断乳后可以继续表达，从而表现出乳糖耐受性 例如，第2号染色体上 MCM6 基因的DNA序列与LCT 基因在断乳后是否继续表达有关，MCM6的特定突变可产生乳糖耐受性。造成乳糖耐受性的基因突变不止一种，多种突变在不同时间独立发源于世界上多个地区非洲、欧洲、中东等），并在后来逐渐融合（这是一种趋同进化）。关于该变异发源的具体时间和地点科学上尚无一致的结论。乳糖不耐是隐性遗传的，即由双亲提供给后代的一对等位基因中，只有当两个都是乳糖不耐基因时，才会表现出乳糖不耐。
乳糖酶缺乏也可能与非遗传因素有关。例如，很多肠炎患者在摄入乳糖后，也会出现消化系统不良反应，但是目前尚不清楚这些症状与乳糖酶缺乏的关联。
乳糖不耐受